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    小麦总RNA的提取

    发布时间: 2015-08-13

     

    实验步骤

     

    1. 所有容器高温灭菌两次,DEPC高温灭菌,所有的试剂用DEPC配制,高温灭菌。

    2. 在一灭菌2mL管中加入:5mol/L异硫氰酸胍0.7mL、苯酚0.4mL、NaAc(pH4.0) 0.1mL。

    3. 称取0.2g小麦黄化苗的叶片,迅速在液氮中研磨成粉末,转入已准备好的离心管中,剧烈震荡。

    4. 混匀,冰浴30min。

    5. 4℃,12000rpm,10min。

    6. 上清至另一离心管中加0.4mL氯仿,剧烈震荡。冰浴放置5min。

    7. 4℃,12000rpm,10min。

    8. 弃有机相(下层) 加入0.4mL氯仿和0.4mL酚,室温放置5min。

    9. 4℃,12000rpm,10min,弃有机相,加入等体积异丙醇。-20℃放置1h。

    10. 4℃,12000rpm,10min,沉淀用70%乙醇洗两次。

    11. 室温稍干燥。

    12. 沉淀加20μLDEPC水溶解(-20℃保存)

    13. RNA电泳:1%琼脂糖胶20mL,8μL样品,1μL样品缓冲液,1μLSYBR,100V恒压电泳,测OD260和OD260/OD280。

     

     

    注意事项

     

    1. 步骤1目的是去除RNA酶(外源)的影响。高温灭菌两次可以破坏RNA酶的复性过程,虽然RNA酶极易复性,但两次连续的高温会打乱它的复性历程,从而使RNA酶失活。 DEPC是RNA酶的非竞争性抑制剂。DEPC可以与RNA酶的活性中心的组氨酸咪脞环上的N结合,从而使RNA酶失活。因为DEPC能与RNA的N结合,从而修饰RNA,所以必须将DEPC最终除去。在高温灭菌时,DEPC因高温分解而挥发。UV也能修饰RNA,实验时应避免。DEPC灭菌后称为DEPC水,它是不含DEPC的。实验过程中要勤换手套,必要时要在超净工作台中进行。

    2. 必须提前准备好变性剂。异硫氰酸胍可以变性RNA酶,也可以破细胞。本试验不可以用酶法破细胞。因为蛋白酶K的适合的条件也可以使RNA酶有活性。 NaAc酸性可以使DNA在有机相(酚相)中,而在碱性条件下,DNA和RNA都在水相中,无法分离。苯酚用于抽提DNA和蛋白质。

    3. 低温防止内源性RNA酶降解RNA。剧烈震荡是使所有的细胞散开,浸在变性剂中。低温的细胞在相对高温的液体中是会形成一团,这样就会使内部的RNA没有水解RNA的机会。小麦的黄化苗因为没有光合作用,所以含糖少,易于抽提。

    4. 步骤6目的是去除脂类。

    5. 步骤8目的是去除脂类和蛋白质。

    6. 步骤9目的是去除糖,脱水,因为体系高盐(2mol/L NaAc),所以可以使RNA沉淀。

    7. 步骤10注意因为提出的量很少,可能不可见,所以离心要有方向标记。

    8. RNA是非常不好溶解的,所以只能稍干燥。若不溶解是因为有太多的糖的残余。

    9. DEPC水中应不含RNA酶。

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